NovaFluor 流式荧光染料 高维分析免疫表型

NovaFluor 流式荧光染料致力于更窄的激发和发射光谱

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MIGRATED CONTENT FOR REFERENCE BEGINS

Invitrogen NovaFluor流式荧光染料

使用NovaFluor检测更多蛋白靶标，同时优化补偿调节

NovaFluor流式荧光染料具有更窄的发射光谱，在光谱流式细胞仪和传统流式细胞仪上充分避免多激光激发，实现更加清晰的细胞分群。它明显优势在于减少光谱溢漏或光谱重叠，避免了补偿调节、减少了荧光扩散，使得检测到更多抗原靶标。NovaFluor流式荧光染料最终目标是整体扩大流式检测能力，并且实现更加清晰的细胞分群，了解更多光谱流式荧光染料产品信息。

 

NovaFluor流式荧光染料的优势包括：

  • 每种NovaFluor流式荧光染料都具有独特光谱特征
  • 激发光谱更窄，单激光激发，避免多激光激发
  • 荧光溢漏减少，实现更加清晰的流式细胞分群
  • 比串联染料可以储存更长时间，且荧光不淬灭
  • 充分利用流式仪器荧光通道来设计流式超高维方案

NovaFluor 染料技术原理

图1.与PE-Dazzle 594相比，NovaFluor 染料具有更窄的激发光谱。

PE-Dazzle 594、NovaFluor Blue 610和 NovaFluor Yellow 610染料吸收光谱极为相似，其中蓝(488 nm)、绿(532 nm)、黄(561 nm)和红(637 nm)激发光谱重叠。这表明PE-Dazzle  594染料会被蓝光和黄绿光同时激发，导致两个荧光通道都被占用；但是将PE-Dazzle染料替换为 ovaFluor Blue 610和NovaFluor Yellow 610染料后，就可以将原本溢漏占用的通道用来检测更多的 一个标志物。

NovaFluor 染料是由Phiton创新技术研发而成，其主要 是使用小分子荧光基团标记的宏观结构。激光之间交叉激发是传统标记方法的常见问题，而 NovaFluor 染料避免了这个问题，而且  NovaFluor 染料的发射光谱很窄，也能减少光谱溢漏到其他的通道。因此，NovaFluor 染料充分利用以往不能同时利用的流式检测通道，使得检测到更多蛋白靶标，还有在单细胞分析和分选中获得更加清晰的细胞分群，最终极致升级流式多色检测能力。

图2.Phiton结构标签染料抗体标记流程 。通过荧光团的数量设定荧光亮度，可得到准确荧光分辨值。Phiton 结构标签偶联到抗体上进行1:1标记，以便后续定量测量。

NovaFluor 在流式中的应用

Panel Builder 光谱流式配色工具

搭配出最佳流式配色方案是很难的，但这却可以由简单的工具来完成。 流式小白和大神都在用的 Panel Builder 流式配色工具可以与您一起轻松完成流式配色，加速流式实验进程。

 

Panel Builder 使用说明

NovaFluor 染料可单独或与其他染料一起用于流式细胞仪。NovaFluor 流式荧光染料的强大优势体现在光谱溢漏减少，完美替代了多激光激发问题、同时溢漏到多通道问题的染料，代替后实现更加清晰的细胞分群。例如，PE-eFluor 610 可被蓝光和黄光激发，随后其发射信号由相应检测器收集光学信息。使用 NovaFluor Blue 610或NovaFluor Yellow 610代替PE-eFluor 610染料能够极大地减少荧光溢漏到相应检测器中，从而可以多检测一个标记物。因此，基于 NovaFluor 流式染料具有很窄的激发光谱和发射光谱，它充分利用流式仪器中的所有荧光通道 ，尤其是目前空闲的检测通道。

 

但 NovaFluor 流式染料与这些染料不可同时使用，包括核酸结合染料（PI、7AAD、DAPI 等）和细胞透化染料（DyeCycle 染料和 SYTOX 死细胞染色剂）。但是，LIVE/DEAD 可固定细胞活性染料可以同时使用，用于检测细胞活性分析。

 

NovaFluor 还有一明显优势是不同亮度的同一荧光染料。在流式多色实验中，NovaFluor 流式荧光染料有不同的亮度，可以相应地匹配到不同表达强度的抗原，从而获得更加清晰的细胞分群。下方的案例是使用两个光谱更窄的 NovaFluor 流式染料代替一个多激光激发的串联染料， 最终允许再添加一个检测靶标。 

 

在经典仪器通道配置中，12色传统染料方案 Verse 14 色加入 NovaFluor 染料方案基于图3和荧光光谱查看器光谱 ，添加或替代染料。

图3.在 Attune NxT 流式细胞仪上应用的两个流式多色方案。将 NovaFluor 加入到Panel中（上表的下半部分），我们可以收集到更多2个靶标的数据。使用 NovaFluor 荧光染料代替了PE及其串联染料后，这个流式方案没有多激光激发问题，允许充分使用蓝光和黄光激发的流式检测通道。 

使用NovaFluor流式荧光染料代替传统串联染料，检测更多靶标

包括传统串联染料的8色Panel 荧光染料 抗原靶标 包括NovaFluor的9色Panel 荧光染料 抗原靶标
V1 Live/Dead Violet 细胞活性检测 V1 Live/Dead Violet 细胞活性检测
V2 BV510 CD16 V2 BV510 CD16
V3 BV605 CD25 V3 BV605 CD25
V4     V4    
B1 FITC CD3 B1 FITC CD3
B2     B2 NovaFluor Blue 610-30S CD19
B3     B3    
Y1     Y1    
Y2 PE-eFluor 610 CD4 Y2 NovaFluor Yellow 610 CD4
Y3     Y3    
Y4 PE-Cy7 CD69 Y4 PE-Cy7 CD69
R1 AF647 CD56 R1 AF647 CD56
R2     R2    
R3 APC-eFluor 780 CD8 R3 APC-eFluor 780 CD8

图4. 使用NovaFluor流式荧光染料代替传统串联染料可以在Panel中检测更多蛋白靶标。使用1 µL LIVE/DEAD Fixable Violet 细胞活性染料（货号L34955）处理正常人外周血单核细胞（1 x 106 cells/孔）30分钟。然后冲洗细胞后，使用CellBlox封闭缓冲液（货号B001T03F01）、Fc Receptor结合抑制多克隆抗体（货号14-9161-71）以及eBioscience流式缓冲液（货号00-4222-26）封闭细胞。然后将细胞分别在两个Panel中染色，上方Panel中的是使用抗人CD4 PE-eFluor 610（5 μL，货号61-0049-42）和下方Panel中的是使用抗人CD4 NovaFluor Yellow 610（5 μL，货号H001T02Y03）和抗人CD19 NovaFluor Blue 610-70S（5μL，货号H004T03B06）代替PE-eFluor。将细胞在4°C下染色 30 分钟，洗涤，然后使用 100 μL eBioscience胞内固定缓冲液（货号 00-8222-49）固定过夜。然后用流式染色缓冲液洗涤细胞，并在 Attune CytPix 流式细胞仪（4 激光配置）上收集到淋巴细胞门内的 30,000 个细胞。收集到的数据通过补偿调节，然后使用FlowJo®软件进行分析。

相比于传统串联染料偶联抗体，NovaFluor流式抗体表现出更少的荧光溢漏

图5.使用NovaFluor抗体代替传统串联染料偶联抗体可以减少荧光溢漏。使用抗人CD4 PE-eFluor 610（5 μL，货号 61-0049-42）、抗人 CD4 NovaFluor Yellow 610（5 μL，货号H001T02Y03）或抗人CD19 NovaFluor Blue 610-70S（5 μL，H004T03B06）分别由UltraComp eBeads Plus 补偿微球（货号 01-3333-42）单独染色。使用eBioscience流式染色缓冲液（货号00-4222-26）染色补偿微球30分钟，洗涤样本，然后在Attune CytPix流式细胞仪（4激光配置）上进行分析（红色箭头表示荧光溢漏）。这里的数据是每个荧光染料在BL2和YL2两个通道中的原始荧光信号，在X轴上有 YL2 和 BL2 通道中的荧光信号强度，表示的是PE-eFluor 610在 BL2通道中的很大溢出。两个NovaFluor流式染料占用各自的主要检测通道（BL2通道、YL2通道），减轻荧光溢漏，这样可以优化补偿调节、检测更多靶标。

传统串联染料荧光溢漏产生的补偿误差最终由NovaFluor流式荧光染料有效调节

包括传统串联染料的8色Panel 荧光染料 抗原靶标 包括NovaFluor的9色Panel 荧光染料 抗原靶标
V1 Live/Dead Violet 细胞活性检测 V1 Live/Dead Violet 细胞活性检测
V2     V2    
V3     V3    
V4     V4    
B1 FITC CD3 B1 FITC CD3
B2     B2    
B3 PerCp Cy5.5 CD4 B3 NovaFluor Blue 660-120S  CD4
Y1 PE CD45RA Y1 PE  CD45RA
Y2     Y2    
Y3 PE Cy5.5 CD8 Y3 NovaFluor Yellow 660 CD8
Y4     Y4    
R1     R1    
R2     R2    
R3 APC-eFluor 780 CD45RO R3 APC-eFluor 780 CD45RO

图6.使用NovaFluor流式荧光染料有效调节使用传统荧光染料产生的补偿误差。使用1μL LIVE/DEAD Fixable Violet细胞活性检测（货号L34955）染色正常人外周血单核细胞（1 x 106 cells/孔）30分钟。洗涤细胞，然后使用CellBlox缓冲液（货号B001T03F01）、Fc受体结合抑制多克隆抗体以及eBioscience流式染色缓冲液（货号00-4222-26）封闭非特异性结合。然后将细胞在两个Panel中染色，一个使用抗人CD4 PerCP-Cy5.5（5μL，货号45-0049-42）和抗人CD8 PE-Cy5.5（5μL，货号35-0088-42），另一个用抗人CD4 NovaFluor Blue 660-120S（5μL，货号H001T03B08）代替PerCp-Cy5.5，同时用抗人CD8 NovaFluor Yellow 660（5μL，货号H003T03Y04）代替PE-Cy5.5。将细胞在4°C下染色30分钟，洗涤细胞，然后使用100μL eBioscience胞内固定缓冲液（货号00-8222-49）固定30分钟。然后洗涤细胞，并在 Attune CytPix 流式细胞仪（4 激光配置）上收集淋巴细胞门的 30,000个细胞数据。收集到的数据进行补偿调节，然后使用FlowJo®软件进行分析。

 

通常科学家们不会在同一Panel中同时使用PerCP-Cy5.5和PE-Cy5.5，这是因为光谱重叠和荧光溢漏。这里数据（表格上方）是在Attune流式仪默认配置中同时使用PerCP-Cy5.5和PE-Cy5.5观察到的补偿调节。PerCP-Cy5.5在YL3通道上的荧光溢漏使得PerCP-Cy5.5阴性群有荧光扩散，最终细胞群不能准确解析。同样补偿调节不准也会引起分析错误，在上方结果图中CD45RA+CD45RO+群中区分不出，在下方结果图中使用NovaFluor流式荧光染料可以清晰区分出CD4和CD8细胞群。NovaFluor流式荧光染料占用主要检测通道，如PerCP-Cy5.5对应BL3通道、PE-Cy5.5对应YL3通道；NovaFluor可以清晰分辨出T细胞Panel中的细胞群，方便后续结果分析和选择合适靶标。

NovaFluor 在Cytek上的表现

下方是利用5激光 Cytek Aurora 光谱流式细胞仪，在不同染色条件中得到的 NovaFluor 流式抗体性能数据。NovaFluor 染料不仅用于传统流式细胞仪，还适用于光谱流式细胞仪；因此它适用于 Cytek Aurora 光谱仪器，下方数据表明 NovaFluor 流式抗体在各种不同测试条件下表现出了优异稳定性能。

在5激光 Cytek Aurora 上， NovaFluor 抗体在固定后稳定的染色指数和MFI值。

A)

 

NovaFluor 抗体在固定后经过很长时间的稳定性。

B)

NovaFluor 荧光染料时间点染色指数MFILog MFI 变化
NovaFluor Yellow 610 anti-human CD8新鲜2810516  
NovaFluor Yellow 610 anti-human CD84小时289927-0.6%
NovaFluor Yellow 610 anti-human CD824小时2510306-0.2%
NovaFluor Yellow 610 anti-human CD85天28120541.5%
NovaFluor Blue 660-120S anti-human CD4新鲜18137054 
NovaFluor Blue 660-120S anti-human CD44 小时17836267-0.2%
NovaFluor Blue 660-120S anti-human CD424小时14735715-0.4%
NovaFluor Blue 660-120S anti-human CD45天17034958-0.6%

图6.在5激光 Cytek Aurora 上，NovaFluor 抗体在固定后稳定的染色指数和MFI值。使用 5 µL Invitrogen CellBlox封闭缓冲液（货号B001T03F01）处理正常人外周血单核细胞（2 x 106细胞/孔），同时使用 Invitrogen NovaFluor Yellow 610 anti-human CD8（10 µL；货号H003T02Y03）和 Invitrogen NovaFluor Blue 660-120S anti-human CD4（4 µL；货号H001T03B08）在冰上染色，避光孵育30分钟。然后使用 50 µL eBioscience 胞内固定缓冲液（货号00-8222-49）结合 50 µL eBioscience流式染色缓冲液（货号00-4222-26）固定细胞30分钟，随后立即收集数据。在染色后4小时、24小时和5天再次收集各样本的数据。在实验期间，将细胞在4°C下避光储存。所有数据均使用5激光 Cytek Aurora 采集，设置流速为30 µL/分，在淋巴细胞门中收集50000 events。最终，数据通过解析算法将自发荧光提取并去除。(A)使用NovaFluor 抗体染色并储存在固定剂中的细胞表现出的时间稳定性。(B)细胞固定对NovaFluor 抗体的染色指数和MFI值的影响。

NovaFluor 抗体在固定剂中储存达14天，使用5激光 Cytek Aurora 得出稳定的相似性指数。

NovaFluor流式荧光染料共轭物在IC固定缓冲液中的稳定性可达14天

C)

相似指数（储存在胞内固定缓冲液中）
NovaFluor 荧光染料3天14天
NB5101.001.00
NB5301.001.00
NB5551.001.00
NB5851.000.99

NB610-30S

1.00​

1.00​

NB610-70S

1.00​

1.00​

NB660-40S

1.00​

1.00​

NB660-120S

1.00​

1.00​

NY570

1.00​

1.00​

NY590

1.00​

1.00​

NY610

1.00​

1.00​

NY660

1.00​

1.00​

NY690

1.00​

1.00​

NY700

1.00​

1.00​

NY730

1.00​

1.00​

NR660

1.00​

1.00​

NR685

1.00​

1.00​

NR700

1.00​

1.00​

NR710

1.00​

1.00​

 

 

相似指数（储存在 Foxp3 固定缓冲液中）
NovaFluor 荧光染料3天14天

NB510

1.00​

1.00​

NB530

1.00​

1.00​

NB555

1.00​

0.97​

NB585

1.00​

0.99​

NB610-30S

1.00​

1.00​

NB610-70S

1.00​

0.98​

NB660-40S

1.00​

1.00​

NB660-120S

1.00​

0.99​

NY570

1.00​

1.00​

NY590

1.00​

1.00​

NY610

1.00​

0.99​

NY660

1.00​

1.00​

NY690

1.00​

1.00​

NY700

1.00​

1.00​

NY730

1.00​

1.00​

NR660

1.00​

1.00​

NR685

1.00​

1.00​

NR700

1.00​

1.00​

NR710

1.00​

0.99​

 

图7.在5激光 Cytek Aurora 上，NovaFluor 抗体在固定剂中储存达14天后稳定的相似指数。使用 5 µL Invitrogen CellBlox封闭缓冲液（货号B001T03F01）处理封闭正常人外周血单核细胞，同时使用Invitrogen NovaFluor Yellow 610 anti-human CD8（10 µL；货号H003T02Y03）和Invitrogen NovaFluor Blue 660-120S anti-human CD4（4 µL；货号H001T03B08）在冰上染色，避光30分钟。使用 50 µL eBioscience 胞内固定缓冲液（货号00-8222-49）结合50 µL eBioscience流式染色缓冲液（货号00-4222-26），或25 µL eBioscience固定/破膜浓缩液（货号00-5123）结合75 µL eBioscience破膜稀释液（货号00-5223）固定细胞30分钟，然后立即收集数据。在染色后3天和14天再次收集相同样本的数据。在实验期间，将细胞在4°C下避光储存。所有数据均使用5激光 Cytek Aurora 收集，设置流速为30 µL/分。简单地说，相似指数是从0到1之间的数值，确定两个荧光染料的光谱特征相近程度。这里比较了每种 NovaFluor 染料在刚染色细胞和固定的细胞中的性能表现，并在分别储存3天和14天后进行染料光谱特征的比较如果相似性指数为0，则认为两种荧光染料的光谱之间没有相似性；如果相似指数≥0.99，则认为这两种有相同的光谱。上方数据表明储存在固定剂中的 NovaFluor 抗体有着很强的荧光稳定性。(A)储存在胞内固定缓冲液中的 NovaFluor 荧光染料的光谱(B)储存在Foxp3固定缓冲液中的 NovaFluor 荧光染料的光谱(C)使用 NovaFluor 染色并储存在Foxp3透化缓冲液或胞内固定缓冲液中3天和14天的细胞相似指数结果。

在5激光 Cytek Aurora 上，NovaFluor 抗体经过长时间光照后仍具光稳定性。

A)

NovaFluor流式荧光染料共轭物在长期暴露于光下时是光稳定的

B)

NovaFluor 荧光染料

4℃光照 vs 室温光照

4℃光照 vs 室温光照

NovaFluor Blue 510

-2.2%

-0.8%

NovaFluor Blue 530

-0.9%

-0.3%

NovaFluor Blue 555

0.0%

0.3%

NovaFluor Blue 585

-1.2%

-4.1%

NovaFluor Blue 610-30S

-3.6%

-2.7%

NovaFluor Blue 610-70S

-0.5%

-3.8%

NovaFluor Blue 660-40S

-3.8%

-2.5%

NovaFluor Blue 660-120S

-1.0%

-3.7%

NovaFluor Red 660

-1.9%

-0.5%

NovaFluor Red 685

-2.6%

-1.6%

NovaFluor Red 700

-2.7%

-1.3%

NovaFluor Red 710

-2.0%

-0.3%

NovaFluor Yellow 570

-1.0%

-0.2%

NovaFluor Yellow 590

-0.6%

0.2%

NovaFluor Yellow 610

-2.2%

-1.8%

NovaFluor Yellow 660

-4.6%

-3.0%

NovaFluor Yellow 690

-2.2%

-1.6%

NovaFluor Yellow 700

-3.1%

-2.1%

NovaFluor Yellow 730

-2.3%

-0.7%

图8.在5激光 Cytek Aurora 上，NovaFluor 抗体经过长时间光照仍具光稳定性。使用 5 µL Invitrogen CellBlox封闭缓冲液（货号B001T03F01）处理正常人外周血单核细胞（2x106细胞/孔）。在96孔板中的每个孔中，由4 µL/sample NovaFluor Blue 510、NovaFluor Blue 530、NovaFluor Blue 555、NovaFluor Blue 585、NovaFluor Blue 610-30S、 NovaFluor Blue 610-70S、NovaFluor Blue 660-40S、NovaFluor Blue 660-120S、NovaFluor Yellow 570、NovaFluor Yellow 590、NovaFluor Yellow 610、NovaFluor Yellow 660、NovaFluor Yellow 690、NovaFluor Yellow 700、NovaFluor Yellow 730、NovaFluor Red 660、NovaFluor Red 685、NovaFluor Red 700和NovaFluor Red 710 anti-human CD4进行染色细胞。在冰上染色，避光30分钟。细胞使用 50 µL eBioscience 胞内固定缓冲液（货号00-8222-49）结合50 µL eBioscience 流式染色缓冲液（货号00-4222-26）固定30分钟，并平均分成3组。然后，将一组细胞避光在4°C下储存，另一组细胞避光在室温储存，第三组细胞在室温储存并暴露在13W的明光下18小时。18小时后，收集3组细胞的数据。所有数据均使用5激光 Cytek Aurora 收集，设置流速为30 µL/分。在淋巴细胞门中收集50,000 events。数据通过解析算法中将自发荧光提取并去除。将在4°C下储存的细胞与室温避光储存的细胞和室温光照储存的细胞进行比较。以在4°C下储存的细胞为标准，计算平均荧光强度的对数变化，<变化为±5%视为可接受。(A)NovaFluor 抗体在光稳定性测试后的光谱(B) NovaFluor 抗体染色细胞后经过光稳定性测试的log MFI值数据比较

在5激光 Cytek Aurora 上，NovaFluor 抗体染色后保存在 CellBlox 缓冲液中稳定的染色指数和染色表现。

A)

NovaFluor 抗体在 CellBlox 缓冲液中一个月以上仍然稳定。

 

B)

NovaFluor 荧光染料时间点染色指数MFIlog MFI 的变化染色指数

NovaFluor Yellow 610

新鲜

28

24

10366

  

NovaFluor Yellow 610

4小时

28

23

12195

1.7%

NovaFluor Yellow 610

24小时

22

17

10129

-0.3%

NovaFluor Yellow 610

5天

30

26

11606

1.2%

NovaFluor Yellow 610

14天

22

26

11776

1.4%

NovaFluor Yellow 610

30天

25

20

10983

0.6%

NovaFluor Blue 660-120S

新鲜

178

178

36602

  

NovaFluor Blue 660-120S

4小时

188

188

38681

0.5%

NovaFluor Blue 660-120S

24小时

197

194

41900

1.3%

NovaFluor Blue 660-120S

5天

228

224

44976

1.9%

NovaFluor Blue 660-120S

14天

202

198

39888

0.8%

NovaFluor Blue 660-120S

30天

206

194

52486

3.4%

图9.在5激光 Cytek Aurora 中，NovaFluor 抗体染色细胞后储存在 CellBlox 缓冲液中稳定的染色指数和染色表现。由 Invitrogen NovaFluor Yellow 610 anti-CD8（30 µL；货号H003T02Y03）、Invitrogen  NovaFluor  Blue 660-120S Anti-CD4（12 µL；货号H001T03B08）、Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液（528 µL；货号B001T03F01）和 eBioscience  流式染色缓冲液（30 µL；货号00-4222-26）制成预混液，然后对正常人外周血单核细胞(1x106细胞/样品）进行染色。在预混液中，NovaFluor 抗体和CellBlox缓冲液使用生产商建议浓度，然后流式染色缓冲液加入到最终体积为100 µL。在制成预混液后分别在0小时、4小时、24小时、5天、14天和30天，将细胞在冰上染色，随后避光30分钟。预混液在4°C下避光储存，且所有细胞均来自同一供体。所有细胞均使用 50 µL eBioscience 胞内固定缓冲液（货号00-8222-49）结合50 µL eBioscience 流式染色缓冲液（货号00-4222-26）固定30分钟。使用5激光 Cytek Aurora 采集数据，设置流速为30 µL/分，在其淋巴细胞散射门中收集50,000 events。数据通过解析算法将自发荧光提取并去除。(A)NovaFluor 抗体在 CellBlox 缓冲液中进行30天进行性能检测的光谱(B NovaFluor 抗体染色并储存在 CellBlox 缓冲液中30天的染色指数、分离指数、MFI值和 log MFI 对数变化的测试结果。

在5激光 Cytek Aurora 上，NovaFluor 抗体与 Ultracomp eBeads 补偿微球、UltraComp eBeads Plus 补偿微球或新鲜细胞混合的相似指数比较。

A)

NovaFluor 抗体与细胞或 eBeads 补偿微球混合后的染色十分相似

B)

  相比于细胞 的相似指数
NovaFluor 荧光染料UltraCompUltraComp Plus

NovaFluor Blue 510

1.00​

1.00​

NovaFluor Blue 530

1.00​

0.99​

NovaFluor Blue 555

0.99​

1.00​

NovaFluor Blue 585

0.99​

1.00​

NovaFluor Blue 610-30S

0.99​

0.99​

NovaFluor Blue 610-70S

1.00​

1.00​

NovaFluor Blue 660-40S

1.00​

1.00​

NovaFluor Blue 660-120S

1.00​

1.00​

NovaFluor Yellow 570

1.00​

1.00​

NovaFluor Yellow 590

1.00​

1.00​

NovaFluor Yellow 610

1.00​

1.00​

NovaFluor Yellow 660

1.00​

1.00​

NovaFluor Yellow 690

1.00​

1.00​

NovaFluor Yellow 700

1.00​

1.00​

NovaFluor Yellow 730

0.99​

0.99​

NovaFluor Red 660

1.00​

1.00​

NovaFluor Red 685

1.00​

1.00​

NovaFluor Red 700

1.00​

1.00​

NovaFluor Red 710

1.00​

1.00​

图10.在5激光 Cytek Aurora 上，相比于新鲜细胞，NovaFluor 抗体与 UltraComp eBeads 和 UltraComp eBeads Plus 补偿微球的相似指数比较。使用 5 µL Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液（货号B001T03F01）处理正常人外周血单核细胞（1x106细胞/孔）。在96孔板中的每个孔中，使用2 µL/sample NovaFluor Blue 510、NovaFluor Blue 530、NovaFluor Blue 555、NovaFluor Blue 585、NovaFluor Blue 610-30S、 NovaFluor Blue 610-70S、NovaFluor Blue 660-40S、NovaFluor Blue 660-120S、NovaFluor Yellow 570、NovaFluor Yellow 590、NovaFluor Yellow 610、NovaFluor Yellow 660、NovaFluor Yellow 690、NovaFluor Yellow 700、NovaFluor Yellow 730、NovaFluor Red 660、NovaFluor Red 685、NovaFluor Red 700和NovaFluor Red 710 anti-human CD4 流式抗体分别染色细胞。细胞在冰上染色，避光30分钟。细胞使用 50 µL eBioscience 胞内固定缓冲液（货号00-8222-49）结合50 µL eBioscience流式染色缓冲液（货号00-4222-26）固定30分钟。相同 NovaFluor 抗体应用对 UltraComp eBeads 补偿微球(货号01-2222-42)和 UltraComp eBeads Plus 补偿微球(货号01-3333-42)这两组中，在冰上染色15分钟，浓度为 1 µL/次，避光。所有数据均使用5激光 Cytek Aurora 收集，设置流速为 30 µL/分。在淋巴细胞门中收集50,000 events，在微球组中收集5,000 events。简单地说，相似指数是从0到1之间的数值，确定两个荧光染料的光谱特征相近程度。这里比较了每种 NovaFluor 染料在刚染色细胞和固定的细胞中的性能表现，并与 UltraComp 补偿微球和 UltraComp eBeads Plus 补偿微球相比较光谱特征。如果相似指数为0，则认为两个荧光染料之间没有相似性；如果相似指数≥0.99，则认为这两个染料是相同的。上方数据表明，UltraComp 和 UltraComp eBeads Plus 补偿微球可以用于数据解析 NovaFluor 染料染色的细胞。(A)NovaFluor 抗体混合于人外周血单核细胞、UltraComp 和 UltraComp eBeads Plus 补偿微球后性能测试的光谱结果(B)在含有 NovaFluor 抗体混合于细胞、UltraComp 和 UltraComp eBeads Plu 补偿微球的染色指数测试结果。

如何选择 NovaFluor 染料

在 流式配色时 荧光染料的关键特征是很重要的，比如荧光染料的相对亮度、每个荧光染料在非主要检测通道上产生的荧光溢漏。 在选择 NovaFluor 流式荧光染料时可以参照下方表1。 流式荧光染料在主要检测通道上的亮度是计算为染色 指数；染色指数越高，表明阳性细胞群和阴性群有更清晰的分离。流式荧光染料的相对染色指数可以在 流式荧光染料染色指数图表中查看， 在这里，每个染料的染色指数都由计算得出，并且按照从暗到最亮依次排列。

 

每个荧光染料在非主要检测通道上会产生多余的荧光信号，这称作为这个染料的荧光溢漏。因为Panel中的每个荧光染料都有可能溢漏荧光信号到非主要通道上，所以在认真选择荧光染料时，非常慎重地考虑荧光溢漏因素。荧光溢漏是由这个荧光染料在所有非主要检测通道上的荧光信号值的总和计算得出；荧光溢漏值越低，细胞分群越清晰。为了确定最佳清晰分群，建议使用的荧光染料是有窄谱发射光谱、且避免多激光激发。

 

表1.流式荧光染料信息。

表中常见的荧光染料特征信息是基于 Cytek Aurora 5 激光64检测通道光谱流式细胞仪上得出的，这些特征包括有最大激发波长、最大发射波长、主要检测通道波宽、主要激发激光、相对荧光溢漏值和染色指数。在染色指数计算中，每种荧光染料偶联的 CD4 抗体标记到 PBMCs 上，然后在 Cytek 仪器获取数据，画出淋巴细胞的门，最终根据主要检测通道上的数据计算出每个荧光染料的染色指数。荧光溢漏相对值是由荧光信号溢漏到其他非主要检测通道中的总和得出，定义为高 High、中 Medium、低 Low三个级别。

荧光染料最大激发/发射波长(nm)主要检测通道*(nm)激光器(nm)荧光溢漏**染色指数*
NovaFluor Blue 510496/511B1（498-518）488低25.5
BB515490/515B1（498-518）488高254.9
Alexa Fluor 488495/519B2（516-533）488低61.8
FITC494/520B2（516-533）488低30.5
Kiravia Blue 520™495/520B2（516-533）488中113.1
NovaFluor Blue 530509/530B2（516-533）488低11.1
Spark Blue™ 550516/550B3（533-550）488低30.1
Alexa Fluor 532532/554B3（533-550）488低7.6
NovaFluor Blue 555494/555B3（533-550）488低10.4
NovaFluor Blue 585494/585B4（571-590）488低19.9
NovaFluor Blue 610/30S509/614B6（605-625）488低29.6
NovaFluor Blue 610/70S509/614B6（605-625）488低46.3
NovaFluor Blue 660/40S509/665B7（652-669）488低36.2
NovaFluor Blue 660/120S509/665B7（652-669）488中54.5
PerCP482/678B8（669-687）488低12.8
PerCP-Cy5.5482/695B9（688-707）488中40.7
PerCP Vio 700482/704B9（688-707）488中33.2
PerCP-eFluor 710482/710B10（707-727）488高144.5
NovaFluor Yellow 570552/568YG1（567-587）561低51.6
PE496/578YG1（567-587）488；561高420.7
CF® 568562/583YG1（567-587）561中180.1
PE-Dazzle 594566/610YG3（605-625）488；561高279.1
NovaFluor Yellow 610552/612YG3（605-625）561中116.0
NovaFluor Yellow 660552/663YG4（652-669）561中95.8
PE-Cy5496/667YG5（669-687）488；561高539.3
NovaFluor Yellow 690552/690YG6（687-706）561低68.1
PE-Cy5.5482/695YG7（706-735）488；561高339.6
NovaFluor Yellow 700552/700YG7（706-735）561低93.0
NovaFluor Yellow 730552/731YG7（706-735）561中125.0
PE-AF700566/719YG7（706-735）488；561中81.5
PE-Cy7496/785YG9（765-795）488；561高352.0
APC650/660R1（652-669）640高230.6
Alexa Fluor 647650/688R2（669-687）640高337.3
NovaFluor Red 660637/659R2（669-687）640低88.5
NovaFluor Red 685637/685R3（688-707）640低113.2
Spark NIR™ 685665/685R3（688-707）640中175.9
NovaFluor Red 700639/700R3（688-707）640低138.8
APC-R700652/704R4（707-727）640高167.1
NovaFluor Red 710639/710R4（707-727）640中105.5
Alexa Fluor 700702/723R4（707-727）640低77.9
APC-eFluor 780633/780R7（772-795）640低138.5
APC-Cy7650/785R7（772-795）640中219.0
APC/Fire™ 750650/787R7（772-795）640低180.9

 

*所有数据是基于5激光 Cytek Aurora 上得出。

**荧光溢漏相对值：<若值<4,000，则为低 Low；若值在4,000-8,000，则为中 Medium；>若值>8,000，则为高 High。

APC/Fire、PE/Dazzle、Spark Blue是BioLegend, Inc.的商标。CF®是Biotium的注册商标。KIRAVIA Blue 520™是SONY Corporation的注册商标。

使用 CellBlox 封闭缓冲液

为了减少NovaFluor 与单核细胞、巨噬细胞等发生非特异性结合，NovaFluor 流式抗体建议与 Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液同时使用，保证抗体最终标记到各种细胞类型上，减少背景噪音标记的影响（图4）。
 

还有，CellBlox 封闭缓冲液也推荐与 Cyanine 染料及其串联染料配合使用来减少与单核细胞和巨噬细胞的非特异性作用，从而避免背景标记（图5）。
 

使用 CellBlox 封闭缓冲液时，多数流式染色实验方案仅需很少改动。将 5 µL CellBlox 封闭缓冲液以及抗体直接加入到 103-8细胞的悬浮液中，最终染色体积为100µL。或者，在标记细胞之前，可向抗体混合物中加入 CellBlox 封闭缓冲液：方法是基于每份染色的样品，向相应的抗体混合物中加入 5 µL CellBlox 封闭缓冲液，最终染色体积为100µL。

  • 在标记细胞时，将CellBlox封闭缓冲液与NovaFluor 抗体搭配使用，最终得到最佳染色结果；
  • CellBlox 封闭缓冲液与所有荧光染料兼容，包括 Invitrogen LIVE/DEAD 可固定细胞活性染料；
  • CellBlox 封闭缓冲液可以应用到任何荧光染料-抗体偶联物，因其很好地减少单核细胞和巨噬细胞的非特异性影响；
  • CellBlox 封闭缓冲液与其他封闭试剂兼容，如 Fc Block、Blocking Protein、Brilliant 染色缓冲液和 Super Bright 染色缓冲液；
  • 使用捕获抗体的微球时，CellBlox 封闭缓冲液不是必须项

使用 CellBlox 封闭缓冲液，参考细胞表面染色实验方案。

图4.CellBlox 封闭缓冲液减少 NovaFluor 染料与细胞间的非特异性结合。

外周血单核细胞 (PBMC) 未进行标记（灰色）或使用 CD3 Monoclonal Antibody (clone UCHT1) NovaFluor Yellow 660（货号H002T03Y04）进行标记，使用 CellBlox封闭缓冲液（货号B001T06F01）的为红色，或未使用的为蓝色。正向散射与侧向散射结果图显示为淋巴细胞和单核细胞(A)，CD3 表达的直方图使用淋巴细胞门(B)和单核细胞门(C)显示。NovaFluor 标记的 CD3 抗体与 CellBlox 封闭缓冲液相搭配，减少单核细胞和巨噬细胞的非特异性标记，这与不含 CellBlox 封闭缓冲液的 CD3 抗体相比，明显提高了准确率。在有着 695/40 nm 带通滤光片的 561 nm 激光器在4激光 Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪上收集数据。

图5.CellBlox 封闭缓冲液减少 Cyanine 串联染料与细胞间的非特异性结合。

外周血单核细胞 (PBMC) 使用 CD14 APC 抗体和 APC-Cyanine 7、PE-Cyanine 7 和 PerCP-Cyanine 5.5 偶联的 CD3 进行染色，含有 CellBlox 封闭缓冲液（货号B001T06F01）的为红色，或不含的为蓝色。正向散射与侧向散射显示淋巴细胞和单核细胞(A)，CD3 & CD14 结果图中含有 CellBlox 封闭缓冲液的为红色，或不含的为蓝色。使用 CellBlox 封闭缓冲液减少与 PE-Cyanine 7(B)、APC-Cyanine 7(C)  和 PerCP-Cyanine 5.5 (D) 串联染料对单核细胞的非特异性结合，减弱背景标记。在4激光 Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪上获取数据，其中对于 PerCP-Cyanine 5.5，使用 488 nm 激光器和 695/40 nm 带通滤光片；对于 PE-Cyanine 7，使用 561 nm 激光器和 780/60 nm 带通滤光片；对于 APC-Cyanine 7，使用 638 nm 激光器和 780/60 nm 带通滤光片。

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"这是在流式技术发展历史上迈出的重要一步。在流式配色时，我直接拒绝了串联染料，轻松清空烦恼，还能检测到更亮靶标，看到细胞清晰分群。这是进展细胞测量学的一个垫脚石。现在，我们有了 NovaFluor 流式荧光染料，这时就不头疼 UV 这种超级昂贵的激光，仍然检测到同样数量的靶标。“

David LeClerc

- 芝加哥大学细胞抗体中心 (CAT) 主任

“所有的 NovaFluor 流式荧光染料有着非常狭窄的激发发射光谱，这比相同波长上的传统流式染料更出色，在我们的Panel上做了完美替代。尤其是 NovaFluor Blue 610、NovaFluor Blue 660和 NovaFluor Yellow 570 特别‘干净’！”

Oliver Burton, Ph.D.

- 生物科学家, Babraham Institute

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