什么是全光谱流式细胞术基础理论？

在传统流式的基础上，全光谱流式不仅拥有着很多相同原理，还有着独特的光学收集和分析特征。在全光谱流式细胞术中，每个荧光染料的发射光谱在定义的波长范围内被一组检测器中所捕获。就这样，每个荧光染料的流式荧光光谱都可以被识别、记录其光谱特征，并在多色实验中充分使用。

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全光谱流式细胞术简介

当单个细胞甚至悬液中的颗粒流过全光谱流式细胞分析仪中的单个或多个激光器时，流式细胞术可以实现对细胞和颗粒快速地鉴定并分析表征。流式细胞仪的检测器可以检测到每个细胞或颗粒的散射光信息和多个荧光信号，最终分析细胞或颗粒上的信息。全光谱流式细胞术就这样可以同时对单个样本中的数百万个细胞进行精准检测，成为当下热门的实验技术！使用全光谱流式细胞术，完成单细胞分析，可以探索出细胞的异质性和单细胞动态变化，其细胞鉴定和表征分析广泛应用于科学研究、生物技术、生物制药和临床应用中。全光谱流式细胞术的常见应用包括免疫学、传染病、肿瘤免疫学、微生物学、生物标志物鉴定和药物发现以及分子生物学。人们越来越想要了解探索复杂的免疫系统，并且利用免疫细胞来提高健康状况，这都使高维细胞检测越来越普及，赛默飞的前沿流式仪器和荧光染料也助力全光谱流式细胞术有了在单个样本中更高的多参数分析能力。


全光谱流式细胞术发展历程

自20世纪70年代初期第一台单个荧光参数检测的商用流式细胞仪推出后，流式细胞术已经发展了数十年 [1]。到20世纪70年代后期，两激光的流式仪器功能升级，不仅可以细胞检测和计数，而且还可以进行细胞分选 [2]。流式分析技术不断发展，有了越来越多的激光器和检测器，从而可以检测更多的参数 [3–5]。近年来，五激光流式细胞仪可以检测到28 个荧光参数 [6]。

尽管流式细胞仪的检测能力有了实质性提升，但人们兴致高昂地期望可以检测整个荧光光谱，因此努力地开发出类似于荧光分光光度计的光谱流式细胞仪。在这里，主要困难是检测单个细胞时荧光信号收集时间非常的短。感谢光学配置和检测器件的研发成果使得光谱流式细胞仪在微秒内取得完整光谱的检测 [7]。

2004 年普渡大学 Robinson 课题组首次发表了流式细胞术的光谱技术方法 [8–10]，Sony Biotechnology 于 2012 年推出了第一台商用光谱流式细胞仪，使用棱镜和光电倍增管 (Photomultiplier tubes, PMT) 来收集和放大光学信息。Cytek Biosciences、BD Biosciences 和赛默飞世尔科技等多家公司也开发出了使用不同信号检测和放大系统的光谱流式细胞仪和光谱细胞分选仪。

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当下有了光谱流式仪器和荧光染料，科学家们能够探索更多蛋白靶标。即刻阅读光谱流式文献，引领科学研究发展。

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比较全光谱流式和传统流式细胞术

在流式细胞仪中，样品的获取和输送通常使用正压或真空驱动系统，而且样品检测的基本物理原理是不变的。然后，单细胞悬液被输入到恒定压力、无湍急流的鞘液流中。在鞘液和样品中的不同压力使细胞在液流中保持单个细胞流动状态，这称为流体动力学聚焦技术。声学辅助流体动力学聚焦技术是将流体动力学聚焦技术和声波产生装置相结合，使细胞更加精确地排列对齐 [13]。

传统仪器和光谱仪器都可以使用光电倍增管 (PMT) 或雪崩光电二极管 (APD) 作为光电检测器。APD 具有比 PMT 更高的量子率，这一属性提高了在 >650 nm的波长下的性能，增强了流式细胞仪的红光和近红外检测能力。在生物实验中，PMT 和 APD 在可见波长范围内的表现是相似的 [14]。

流式Panel设计需要考虑仪器配置、相应荧光染料、靶标蛋白的表达水平和画门分析思路 [15]。一般来说，全光谱流式的Panel设计遵循与传统流式相同的原则，包括画门思路、匹配荧光染料亮度与抗原强度、分析并减少荧光溢出及扩散误差，还有设置多种实验对照。但是，设计光谱Panel需要考虑更多因素 [12]。还有，全光谱流式与传统的流式一样，最终数据结果存储为Flow Cytometry Standard (FCS) 格式文件，后续统计分析，报告细胞特征。

 传统流式细胞仪全光谱流式细胞分析仪
荧光染料的检测波长范围接近发射波长最大值~350–900 nm
检测器(荧光染料)数量一个多个
修正荧光溢出方法补偿调节光谱解析
选择荧光染料考虑光学配置考虑荧光染料的光谱特征是否唯一
去除自发荧光否是

表 1. 传统流式和全光谱流式的主要特征比较。
 

了解更多：流式细胞术基础知识

区分全光谱和传统流式细胞术：

  • 由光电检测器收到的发射光带宽
  • 检测每个荧光染料的检测器数量
  • 区分出不同荧光染料光谱的算法

在传统流式细胞术中，每种荧光染料都是在单个目标检测通道中进行检测，使用带通或长通滤光片收集发射光谱中的波峰处光谱信息。其他荧光染料会在这个目标检测通道中有发射光的荧光溢漏，这时通过补偿来做调节（图 1）。

图 1. 比较传统和光谱流式的光学检测配置 (A) 在传统流式上，使用单个检测通道来收集单个荧光染料的发射光信息，仅收集一部分发射光；通过补偿调节荧光溢漏误差。(B) 在光谱流式上，使用多个检测通道来收集所有荧光染料的全部发射光谱信息；通过解析区分不同荧光染料。

 

相比来说，全光谱流式细胞术是使用多个检测通道来检测的，获得每个激光下荧光染料的全部发射光谱信息，最终得到清晰的荧光光谱特征。重点是最终得到的完整光谱都是有其特征之处（图 2）。传统流式使用补偿来调节荧光溢出，而全光谱流式通过光谱解析来区别出每个荧光染料。光谱解析是通过数学算法，根据荧光染料的独特光谱特征，区分出多色样本中的单色荧光。通过这种方法，可以区分出波峰相近、完整光谱不同的荧光染料，最终在一个Panel中使用；而这在传统流式中不能实现。最后，光谱流式还可以从荧光信号中摘取细胞的自发荧光，提高数据结果准确性 [1,16]。

图 2. 光谱特征。多激光激发荧光染料得到其光谱特征。在上方示例中，每个激光激发、每个检测通道接收的荧光信号最终得到独特光谱特征。(A) 使用五激光 Cytek Aurora 光谱流式细胞仪，获得Invitrogen Brilliant Ultra Violet 737 荧光染料光谱特征。(B) 使用七激光Invitrogen Bigfoot 光谱流式分选仪，获得Invitrogen Brilliant Ultra Violet 737 荧光染料光谱特征。

 

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全光谱流式细胞术优势

科学家们希望在单个样本中得到尽可能多的信息，这促使了流式仪器和荧光染料的快速发展。有了精致的Panel，全光谱和传统流式都能做出非常详尽的数据结论。然而当科学家想要打破传统、检测到更多参数时，赛默飞光谱流式产品中有很多实用荧光染料，充分收集到完整光谱信息。这样可以使用在传统流式不能同时使用的荧光染料，轻松实现40色以上的免疫分型检测实验 [17,18]。

而且，全光谱流式可以将细胞的自发荧光作为单独的检测参数，比作它是Panel中的一个荧光染料。在流式实验中，得到自发流式荧光光谱，将其从目标信号中去除背景干扰，这将获得更加准确的目标荧光信号。全光谱流式不仅会有每个荧光染料的更多信息，而且能解析出发射波峰相似、完整光谱不同的荧光染料，最终提高数据的准确性、细胞分群的深层结论。这都在Panel设计中有了更多参数和更多选择。

使用赛默飞光谱流式分选仪和荧光染料，科学家们现在兴奋地选择合适靶标来鉴定和分选细胞。但流式配色（Panel Design）越来越复杂、细胞亚群表型也很多样，这需要丰富的配色经验、准确的结果分析和标准实验步骤[19]。即刻联系赛默飞科学家开始流式配色，将更多检测靶标加到您的Panel中，打开更加开阔的免疫世界！

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参考文献和阅读材料
  1. Wade CG, et al.(1979) Spectra of cells in flow cytometry using a vidicon detector.J Histochem Cytochem 27:1049–52.
  2. Robinson, JP (2004) Multispectral cytometry: The next generation. Biophoton Int 36–40.
  3. Goddard G, et al.(2006) Single particle high resolution spectral analysis in flow cytometry.Cytometry A 69:842–51.
  4. Robinson, JP, Grégori, G, Rajwa, B, Jones, J, Patsekin, V. Multispectral detector and analysis system.Purdue University assignee USA patent 72,802,042,007 (2007).
  5. Gregori G, et al.(2011) Hyperspectral cytometry at the single-cell level using a 32-channel photodetector.Cytometry A 81:35–44.
  6. Futamura K, et al.(2015) Novel full‐spectral flow cytometry with multiple spectrally‐adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A 87: 830–842.
  7. Nolan JP, Condello D (2013) Spectral Flow Cytometry.Curr Protoc Cytom Unit1.27.
  8. Watson DA, et al.(2008).A flow cytometer for the measurement of Raman spectra.Cytometry A 73:119–28.
  9. Roederer M, et al.(1997) 8 color, 10-parameter flow cytometry to elucidate complex leukocyte heterogeneity.Cytometry A 29:328–39.
  10. De Rosa SC, Roederer M (2001) Eleven-color flow cytometry.A powerful tool for elucidation of the complex immune system.Clin Lab Med 21:697–712, vii.
  11. Perfetto SP, et al.(2004) Seventeen-colour flow cytometry: unraveling the immune system.Nat Rev Immunol 4:648–55.
  12. Gauci MR, et al.(1996) Observation of single-cell fluorescence spectra in laser flow cytometry.Cytometry 25:388–93.
  13. Schmutz S, et al.(2016) Spectral cytometry has unique properties allowing multicolor analysis of cell suspensions isolated from solid tissues. PLoS ONE 11.
  14. Sander CK, Mourant JR (2013) Advantages of full spectrum flow cytometry.J Biomed Opt 18:037004.
  15. Lawrence GW, et al.(2008) Enhanced Red and Near Infrared Detection in Flow Cytometry Using Avalanche Photodiodes.Cytometry A 73:767–776.
  16. Feher K, et al.(2016) Multispectral flow cytometry: The consequences of increased light collection.Cytometry A 69:681–689.
  17. Novo D, et al.(2013) Generalized unmixing model for multispectral flow cytometry utilizing nonsquare compensation matrices. Cytometry A 83A:508–520.

仅供科研使用，不可用于诊断目的。