哺乳动物表达基础支持 - 入门

尽管哺乳动物表达更为耗时，也不如其他类型的宿主系统那样方便和经济，但其对于在最为生理相关环境中研究某些特定蛋白功能的应用而言是最佳选择，这主要是因为哺乳动物表达系统具有最高水平的翻译后蛋白修饰能力。

此处列举了哺乳动物表达系统相对其他宿主系统具有的优势和缺点：

在建立稳转细胞系的过程中，获取一条剂量效应曲线或杀死曲线是确定抗生素最佳使用浓度的简单方法。为了确定导致细胞完全死亡所需的最低抗生素用量，我们将未经转染的细胞培养于含不同浓度抗生素的培养基中。获取剂量效应曲线或杀死曲线的基本步骤如下：

• 以25%的汇合度铺板未转染细胞，并将它们培养于抗生素浓度逐渐增加的培养基中进行生长。对于某些抗生素而言，您可能需要计算活性药物的用量以控制不同批次间的差异。
• 每3-4天补充一次选择性培养基。10-12天之后，检查培养皿中活细胞的数量。细胞死亡发生之前，细胞可能会在选择培养基中分裂一至两次。
• 观察能够导致细胞完全死亡的最低抗生素浓度。这就是可用于稳转筛选的最佳抗生素浓度。

真核细胞的转录终止信号尚不清楚。在我们的哺乳动物表达载体中，转录终止过程是通过多克隆位点下游的SV40 polyA尾，BGH polyA尾或TK polyA位点所介导的。

保守的Kozak序列为A/G NNATGG，其中的ATG表示起始密码子。ATG周围的核苷酸点突变会影响翻译效率。尽管我们通常情况下都推荐加入一段Kozak保守序列，不过这一操作的必要性还是基于具体的目的基因，一般只需ATG就足以高效地启始翻译过程。最佳的建议是保持cDNA中天然起始位点，除非确定这一位点的功能性不理想。如果从表达的角度来考虑，推荐构建并测试两种载体，一个具有天然的起始位点，另一个具有保守的Kozak序列。通常情况下，所有具有N-融合表达的表达载体都已经包含了一个翻译起始位点。

我们未提供带有可切割C-端标签的哺乳动物表达载体。

不会；即使转录本会形成，也不存在核糖体结合位点（RBS）或Shine Dalgarno序列来启始翻译过程。大肠杆菌中会转录mRNA，但这一信使无法翻译为蛋白质。

我们所有的抗生素（Geneticin，Zeocin^TM，潮霉素B，杀稻瘟素和嘌呤霉素）均可共用于多重稳转细胞系的建立。不过，需要针对每一种抗生素组合来获取杀菌曲线，因为当与其他抗生素联用时，细胞对某一特定抗生素的灵敏性会出现增加的趋势。

我们所提供A、B和C型载体之间的差异在于载体多克隆位点（MCS）中增加或删除了单个碱基。这些单个碱基的改变在每种类型的载体上形成了三种不同的阅读框。这些特性将帮助用户通过特定的限制性内切酶，来将目的基因插入表位标记的阅读框。三种阅读框A、B和C的载体将以三个独立的试剂管形式提供。

在小鼠细胞系中，人们已知CMV启动子的效率会随时间延长而逐渐下降。因此，我们推荐您使用一款非CMV型的载体，如EF1α或UbC启动子，以在小鼠细胞系中长时间表达蛋白。

我们推荐使用One Shot ccdB Survival^TM 2 T1^R 感受态细胞，货号A10460。该菌株能够耐受ccdB基因的毒性效应。

注意： 请勿使用常规的大肠杆菌克隆株 - 包括TOP10或DH5α^TM - 来进行扩增和培养，因为这些菌株均对ccdB的效应很敏感。

我们提供pJTI^TM R4 Exp CMV EmGFP pA载体，货号A14146，您可使用这一产品来监控转染和表达情况。

为pcDNA^TM3.1——后一载体源自于pcDNA^TM3载体。原始pcDNA^TM3载体多克隆位点（MCS）的中心包含了mRNA发卡结构的同源序列和Eag I，Not I和BstXI序列。这一发卡结构只会影响Not I位点下游插入基因的表达效率，如果这种影响存在的话。为了解决这一问题，我们移除了一些序列，包括Eag I位点，而BstXI序列也经过些许调整以降低同源性。一条源自pcDNA^TM3载体，包含了Sp6引物位点的32碱基片段（介于995号碱基与1026号碱基之间）也被移去，替换为一条11碱基的片段，从而向pcDNA^TM3.1载体的多克隆位点中引入了另一个PmeI限制性酶切位点。

（+）和（-）指示符意味着这些载体中多克隆位点的方向。提供两种不同方向插入的克隆位点为用户提供了设计克隆方案的灵活性，举例来说，如果您的克隆需要按照Not I-Bam HI的方向插入，您就可选择这一载体的（-）版本。

pcDNA^TM3.1载体包含了转录起始位点之前截短的CMV核心启动子，而pcDNA^TM 3.3-TOPO载体拥有672 bp完整的天然CMV启动子。天然的CMV启动子相比其他类型的表达载体能够产生超出二至五倍的表达蛋白得率。pcDNA^TM3.1载体有限制性酶切，TOPO和Gateway克隆方式以及带标签和不带标签的版本可供选择，而pcDNA^TM3.3-TOPO载体为TOPO TA改造的无标签载体，能够用于表达不含外源氨基酸的天然蛋白，因此成为了抗体生产与结构生物学的理想之选。

pcDNA^TM4/HisMax与pcDNA^TM4/HisMax-TOPO载体含有QBI SP163翻译增强子，能够将蛋白表达水平增加至单独CMV启动子时的二至五倍以上。

我们提供三类独特的哺乳动物表达系统来帮助用户实现目的基因可诱导/调控性的表达。

• T-REx^TM系统
• Flp-In^TM T-REx^TM系统
• GeneSwitch^TM系统

请参见下表中的比较结果：

我们提供T-REx^TM-293，-HeLa，-CHO和-Jurkat细胞系。这些细胞系都源自细胞转染了pcDNA^TM6/TR，，之后通过杀稻瘟素的稳转筛选来获得这些阳性细胞。它们持续和稳定地表达TetR基因，因此在使用T-REx^TM系统的过程中能够帮助用户显著地节省时间和精力。这些细胞系通过瞬转阳性对照载体pcDNA^TM4/TO/LacZ，可功能性地检测表达。在抑制状态下它们表达出极低的bGal基底表达水平，而在四环素诱导条件下可实现高表达。

Gateway pT-REx^TM DEST31载体包含了N-端的6xHis标签（这一载体中6XHis标签后面未跟随甘氨酸（G）或-COOH）。因此，这一标签无法通过anti-HisG或anti-His（C端）抗体实现检测。作为替代，我们推荐使用anti-6xHis抗体（货号 372900）。

我们未提供anti-TetR的抗体。即使使用anti-TetR抗体的免疫印迹技术能够筛选出不表达TetR蛋白的克隆，这也不能作为筛选功能性克隆的理想方法。通过瞬转表达LacZ的对照质粒来进行功能测试可以满足这一需求，用户可挑选那些在无四环素条件下β-半乳糖苷酶表达水平极低，而加入四环素后β-半乳糖苷酶表达水平极高的那些克隆。

强力霉素可作为T-REx^TM系统中诱导剂的代替品。它的作用机理与四环素相近，并在T-REx^TM系统中表现出与四环素相似的剂量效应和诱导性质。强力霉素显示出比四环素更长的半衰期（分别为48小时和24小时）。我们未提供强力霉素，但用户可从Sigma（货号D9891）进行购买。

Flp-In^TM T-REx^TM系统将Flp-In^TM系统的靶向整合与T-REx^TM系统的强大诱导表达能力整合在一起。该系统能够生成同基因，可诱导的稳定表达细胞系，并能够针对这些细胞系实行多克隆筛选。一旦建立了包含整合FRT位点的Flp-In^TM T-REx^TM宿主细胞系，后续建立表达目的基因的Flp-In^TM T-REx^TM细胞系就变得迅速高效了。

我们提供向HEK293细胞中稳定整合了pFRT/lacZeo和pcDNA6/TR的Flp-In^TM T-REx^TM系统。该细胞系经功能性测试，能够有效调控目的基因的表达。

使用GeneSwitch^TM系统能够确保目的基因处于极低的基础表达水平，而T-REx^TM系统可能会有少量渗漏表达，因为FBS中不可避免的存在着一些四环素。GeneSwitch^TM系统的诱导表达水平可能甚至高于CMV启动子。GeneSwitch^TM系统的劣势在于，尽管该系统能够在转基因条件下以优异的性能工作，但在培养系统中关闭表达的操作不是很容易实现。而另一方面，T-REx^TM系统可通过加入和去除诱导剂来切换开关状态。

当执行共转染时，用户无法在稳转细胞系中同时完成功能性TetR或GeneSwitch^TM蛋白的双重测试。另一方面，如果执行连续转染，用户就可对所生成的T-REx^TM或GeneSwitch^TM细胞系进行功能性测试，他们可将LacZ对照表达质粒瞬转进入细胞，并挑取那些在诱导剂缺乏条件下表达LacZ的本底水平最低，而在含诱导剂条件下LacZ表达水平最高的克隆。之后可对这一克隆进行扩增，并按需用于T-REx^TM或GeneSwitch^TM表达载体的转染实验。

GeneSwitch^TM蛋白包含了源自不同转录因子的功能域，可作为配体依赖的转录因子行使功能，来激活目的基因或自身内源基因的表达。GeneSwitch^TM能够表现出如下属性：

• 由于GAL4 DBD来源于酵母蛋白，GeneSwitch^TM蛋白不会对内源基因造成影响，而只会激活GAL4 UAS元件所控制那些基因的转录过程（即目的基因和调节性融合基因）。
• GAL4 DBD能够以同源二聚体的形式结合独立的17核苷酸GAL-4结合位点。pGene/V5-His与pSwitch质粒中分别包含了6个和4个拷贝的GAL4结合位点，但尚不清楚是否所有这些GAL4-结合位点在任意时间都处于占用状态。
• 截短型的hPR-LBD的C-端截去了19个氨基酸，从而失去了与孕酮，其他内源的甾族荷尔蒙及其他孕酮激动剂的结合能力，但仍能够与米非司酮进行高亲和力的结合。
• p65 AD是一个强力的转录激动剂且来源于人体蛋白，因此能够最大程度的减少可能存在的毒性或病毒转录激活域相关的多效影响。

抱歉，所有的GeneSwitch^TM细胞系均已停产。

Ecdysone载体与细胞系已经停产了，不过我们仍继续提供诱导剂米乐甾酮A与松甾酮A。

在理论上来讲，用户能够实现Flp-In^TM表达载体的多重整合效果——这其中包含了一个FRT-特异性的整合事件和一个随机的第二位点整合事件。不过，随机整合的发生概率相对较低。转染过程中所用DNA的有限数量将减少第二位点的整合概率。我们向293细胞（缺少FRT位点）中转染了pcDNA^TM5/FRT载体，并在筛选了200个以上的克隆后，鉴定到一个潜在的第二整合位点。用户可通过Southern杂交来检测DNA的整合位点。单一整合元件会显示为独立的一个条带；两个整合位点：两个条带；三个位点，三条带，如此延续。我们将一些Flp-In^TM表达细胞系培养了四个月以上，无论是否向培养体系中加入潮霉素，均未发现Flp-In^TM表达载体发生任何形式的丢失。

Jump-In^TM系统是由PhiC31-整合酶所介导的一个不可逆转的哺乳动物稳定定向表达系统。这一系统是由Jump-In^TM Fast系统和Jump-In^TM TI^TM（定向整合）系统所组成，前者包含了单一的整合步骤，后者则需要两个整合步骤，两者都是定向且不可逆的。相比而言，Flp-In^TM系统是一款可逆和稳定的哺乳动物靶向表达系统。第一步整合是随机的（pFRT/lacZeo的整合），而第二步整合（Flp-In^TM表达载体的整合）是定向但可逆的。

如果您需要稳定的哺乳动物表达效果，并希望快速获得良好表达的克隆时，我们推荐您使用Jump-In^TM Fast系统。您可通过PhiC31 假（pseudo）-att P位点上的一次或多次整合来获得良好表达的细胞克隆。用户有必要使用Southern杂交来确定整合的数目。如果您需要完成同基因的表达操作，则可选择Jump-In^TM TI^TM系统，这一系统可以确保所有的克隆基因都处于同一整合位点和背景水平，而不会出现染色体位置效应。

获得单拷贝所需的DNA用量可能要通过不含整合酶的对照试验来确定。在不含整合酶的条件下，生成低于5个克隆时的DNA用量可用于后续含整合酶的实验。一般来说，整合酶表达质粒占转染所需DNA量的大部分。

当R4 attP重定位（retargeting）序列通过PhiC31 Int介导的重组反应，位点特异性地插入哺乳动物基因组中时，平台细胞系就建立了。除R4重定位序列之外，整合事件还会基于所用的平台载体（即pJTI^TM/Bsd，pJTI^TM/Neo或pJTI^TM/Zeo），来将潮霉素抗性基因（由HSV TK启动子控制），不含启动子的Bsd，Neo或Zeo抗性标志物导入细胞内。尽管您会按照对潮霉素的耐受性筛选出那些携带了R4重定位序列的转化子，您可能还是需要执行PCR分析，来检查R4 attP重定位序列的整合情况。为了实现此种目的，我们推荐用户使用平台细胞系的基因组DNA来扩增从R4 attP序列至适当耐药标志物（基于所使用的平台细胞系）之间的序列。我们推荐用户使用巢氏PCR来降低初始PCR过程中可能观察到的高背景情况。此外，您也可通过PCR扩增一条1.5 kb左右、覆盖重定位序列的区域来制作一条DNA标记探针，之后执行Southern杂交分析。Southern杂交也可作为附加测试，来验证重定位序列向基因组中的整合是否为单一拷贝。

靶向整合的第二步骤为R4整合酶所介导的重定位事件，这一事件中目的遗传元件由重定位表达载体（使用MultiSite Gateway Pro模块建立）所携带，位点特异性地整合进入平台细胞系的基因组中。整合事件也会将EF1α启动子放在杀稻瘟素，新霉素或Zeocin^TM抗性基因（即 “无启动子”的筛选标志物）的上游，因此就可通过适当的筛选试剂来筛选出成功实现“重定位”的转化子。尽管您使用了杀稻瘟素，新霉素或Zeocin^TM抗性基因筛选出了成功实现重定位的克隆，您可能还是需要进行一个巢氏PCR来扩增从EF1α启动子至适当抗性基因之间的区域。您还可扩增潮霉素抗性基因，来作为一个阳性对照。与建立平台细胞系类似，您也可针对您的目的基因设计探针来开展Southern杂交分析。

pJTI^TM Phic31 Int载体不含NLS信号。加入NLS信号可能会增加假attP位点的特异性整合效率，但尚未获得支持数据。有一篇文献描述了在PhiC31整合酶载体上NLS信号的应用，但作者未检测假attP位点的整合情况。

我们推荐您在用于建立平台细胞系的质粒中加入一个表达标志物/报告基因，之后通过该标志物的表达情况来筛选平台细胞系，以鉴定出一个高表达位点。否则，这一过程会非常繁琐，重定位后需要筛选大量的克隆。