Dynabeads核酸纯化支持 - 问题排查

一般来说，我们不建议冷冻Dynabeads磁珠，因为冻融过程会使磁珠表面形成裂缝，导致从磁珠中释放铁，污染样本。反复冷冻/融化过程会加剧该效应，必须避免。对于表面包被了抗体的Dynabeads磁珠，尤其需要注意，否则会损坏这种磁珠表面抗体的性能。我们推荐将Dynabeads磁珠在2-8℃直立放置保存，确保磁珠浸没于缓冲液中（干燥会降低性能）。始终切记，在使用前一定要完全重悬磁珠并妥善清洗。

请查看以下可能原因：

• 溶液太粘稠。
• 蛋白质间相互作用导致磁珠聚集。

尝试以下建议：

• 延长分离时间（将管子留在磁力架上2-5分钟）。
• 向裂解液中加入DNase I（约0.01 mg/mL）。
• 将结合和/或清洗缓冲液中的Tween20浓度增加至约0.05%。
• 向结合和/或清洗缓冲液中加入最多至20 mM 的β-巯基乙醇。

链霉亲和素分子是共价结合到磁珠表面的；在正常的推荐条件下，可以检测到十分微量泄漏（37°C下，2个月后，低于链霉亲和素总结合量的0.2%）。然而，应注意的是，并非所有4个链霉亲和素亚基都是与磁珠共价偶联的。通常，只有1或2个亚基是共价偶联的。链霉亲和素与其他蛋白质相似；一旦加热，链霉亲和素就会变性并分离成亚基。例如，如果煮沸Dynabeads链霉亲和素磁珠，一些链霉亲和素亚基将从磁珠中释放出来（以单体或聚集物的形式）。共价结合的链霉亲和素亚基不会受到加热处理影响。当链霉亲和素与生物素结合时，链霉亲和素-生物素复合物比未结合生物素的链霉亲和素分子更稳定。

链霉亲和素偶联的Dynabeads磁珠的结合能力取决于片段长度。可能由于空间位阻的存在，磁珠对长DNA或RNA片段的结合能力较低。对于大于2kb的长DNA或RNA片段，我们推荐使用Dynabeads KilobaseBINDER™试剂盒。以下是关于优化结合能力的一些建议。

• 盐浓度可影响生物素化核酸与Dynabeads链霉亲和素磁珠的结合效率。使用1 M NaCl（终浓度）在25℃下孵育15分钟，是生物素化DNA片段（最大1kb）的最佳结合条件。较长的DNA片段应固定过夜。生物素化抗体应在含0.1% BSA 且pH 7.4的PBS缓冲液中固定。
• 应确保您的样本不含过量的游离生物素，因为游离生物素与Dynabeads链霉亲和素磁珠结合的速度比较大的生物素化分子更快。应使用反向HPLC或FPLC回收生物素化寡核苷酸，以去除样本中存在的游离生物素。
• 由于待固定的特定分子的大小和生物素化过程都将影响磁珠的结合能力，因此我们推荐采用滴定法优化每个独立应用中的磁珠使用量。

维持高pH和低盐浓度，将有助于维持核酸和磁珠表面的负电荷。

高背景可能是由磁珠表面的BSA非特异性结合或者链霉亲和素的非特异性结合引起的。升高pH或盐浓度，都有助于减少非特异结合。建议改用Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠，这些磁珠无BSA包被，且由于其是基于羧基活化的而具有亲水性。

DynabeadsM-270链霉亲和素磁珠和Dynabeads MyOne™链霉亲和素C1磁珠表面具有负电荷。在一些样本中，磁珠的表面电荷可能引起磁珠漂浮或变粘稠或聚集。粘稠可能是由磁珠间或磁珠与管壁间的静电作用造成的。一般来说，我们推荐在实验前使用Tween 20等非离子去污剂清洗磁珠。通常，只需向磁珠中添加Tween 20洗涤剂（终浓度最高为0.1%），随后使用不含去污剂的缓冲液重悬和洗涤，即可减轻或消除这个问题。可能需要在Tween 20溶液中孵育一定时间，例如，室温下旋转孵育5-10分钟。此外，我们推荐使用硅化试管。这样处理最有可能减弱磁珠的静电势。

我们不推荐这样做，否则链霉亲和素变性时会变为疏水性并发生聚集。

通过从洗脱液中再次提取mRNA，可以有效清除核糖体RNA。可重复利用初始分离时所使用的相同Dynabeads Oligo(dT)25磁珠。使用洗涤缓冲液B清洗磁珠2次。以4倍体积的裂解/结合缓冲液稀释洗脱mRNA，随后加入磁珠。在室温下孵育并混匀3-5分钟，随后继续执行直接mRNA分离实验方案。

DNA污染的原因有多种：

• DNA剪切不完全。
• 在杂交步骤后，未完全去除样本裂解液。
• 清洗不完全和/或洗涤缓冲液去除不完全。
• 样本与磁珠的比例过高。

PCR可能被抑制剂抑制，或PCR循环数不足。对于抑制剂，应确保洗涤缓冲液恢复到室温后再使用，并增强加入缓冲液的力度。还应确保每一次清洗步骤中都完全去除上清液，或增加一次额外的清洗步骤。

我们推荐用重悬缓冲液，水或低离子强度的缓冲液65°C孵育5分钟以上来洗脱DNA。洗脱前确保复合物被充分重悬。重悬缓冲液可预热至65°C。孵育后将管子放在磁力架上30秒，把上清移至另一干净的管子中。你可以用部分洗脱的DNA进行琼脂糖凝胶电泳来评估洗脱效率。或者你也可用Dynabeads做模板进行PCR来评估残留在磁珠上的痕量DNA。加更多预热的洗脱缓冲液对提高洗脱效率会有帮助。

高PCR背景可能是由过高的模板DNA、引物、Mg2+或dNTPs浓度所致。为解决这个问题，可以减少模板DNA、引物、酶和Mg2+的使用量，在PCR扩增前洗脱DNA，以及尝试使用热启动PCR。高背景也可能是由污染所致。应确保每次洗涤都完全去除上清液，避免残留。

我们建议检查白细胞的计数及/或提高样本质量和数量。

您可以尝试延长移液吹打时间，或在粗糙表面（如铁制螺纹管架）上快速移动试管进行振荡。您也可以尝试使用孔径更小的移液管。

您可尝试以下建议：

• 如果在清洗过程中，发现复合物出现片段化，则减小加入洗涤缓冲液的力度。
• 如果进行洗脱，则可能是洗脱无效。在加入重悬缓冲液前，确保已去除所有洗涤缓冲液。重悬时，增强混匀复合物的力度。
• 提高样本质量和数量。

您可尝试以下建议：

• 红细胞裂解可能不完全；延长孵育时间或重复红细胞裂解步骤。
• 增强加入洗涤缓冲液的力度。
• 确保每次清洗时都完全去除上清液。
• 使用更少的PCR起始材料。

最大原因是在使用裂解/结合缓冲液配制洗涤缓冲液1时加入了异丙醇。使用劣质异丙醇（不是分子级）会引起快速变黄。高质量的醇类不会引发这样的问题。