1．怎样按照使用浓度溶解引物？
2．引物（含修饰）的分子量是如何确定的？
3．如何计算引物的Tm值？

 

1．怎样按照使用浓度溶解引物？

了解以下几个参数：
1OD引物干粉约为33微克；
碱基的平均分子量为324.5；
引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量；
引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量

举例：如果您拿到一管标明为2OD的20碱基的引物，
分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66μg
摩尔数=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol
若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。

同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的水充分振荡溶解。

 

2．引物（含修饰）的分子量是如何确定的？

非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.

NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。


常规碱基分子量

BaseMolecular Weight
A313.21
C289.18
G329.21
T304.19
I314.2
U290.17


常规修饰基团分子量

常规修饰基团分子量常规修饰基团分子量
5’-Biotin405.453’-TAMARA623.60
5’-(6 FAM)537.463’-Dabsyl498.49
5’-HEX744.133’-(6 FAM)569.46
5’-TET675.243’-Amino Modifier C3153.07
5’-Cy5533.633’-Amino Modifier C7209.18
5’-Cy3507.593’-Thiol Modifier C3154.12

 

3．如何计算引物的Tm值？

引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。